Действие первое: "Церковь Сант-Андреа делла Валле". Политический заключённый Чезаре Анджелотти, бежавший из тюрьмы, входит в церковь, в капеллу своей сестры маркизы Аттаванти. Затем появляется художник Марио Каварадосси и снимает покрывало с картины, над которой он работает. Ризничий узнаёт в образе Марии Магдалины черты недавно молившейся в церкви незнакомки. Он возмущён этим сходством. Каварадосси сравнивает картину с миниатюрой, изображающей его возлюбленную, Флорию Тоску, и размышляет об искусстве и красоте ("Recondita armonia"; "Свой лик меняет вечно").
Когда ризничий уходит, Анджелотти пытается незаметно выйти из капеллы, думая, что церковь пуста. Увидев Каварадосси, он узнаёт своего друга и рассказывает ему о побеге. Художник отдаёт беглецу корзинку с едой и прячет внутри капеллы, так как в церковь входит Тоска, знаменитая певица. Донёсшийся до неё шёпот вызывает её ревность. Она зовёт Каварадосси сегодня вечером в их убежище, уединённый домик ("Non la sospiri la nostra, casetta"; "Наш домик маленький"). Тоска уже собирается уходить, как вдруг замечает картину и узнаёт в образе Магдалины маркизу Аттаванти. Каварадосси удаётся успокоить её.
После её ухода Анджелотти переодевается в женскую одежду, приготовленную для него сестрой. Раздаётся пушечный залп, возвещающий о побеге узника, и Каварадосси решает проводить друга в их с Тоской домик и спрятать в потайной нише колодца (дуэт "E buona la mia Tosca"; "Добра душою Тоска"). Едва они уходят, как церковь наполняется клириками, служками, певчими: по случаю победы над Наполеоном готовится торжественное богослужение.
В церковь входят также начальник полиции Скарпья и его шпионы. Они обнаруживают в капелле Аттаванти веер с гербом маркизы и корзинку из-под еды. Теперь хитрому начальнику всё ясно. Он использует ревнивый характер Тоски: показывает ей веер, и та устремляется на загородную виллу маркизы, думая найти там изменника Марио. Скарпья посылает Сполетту следить за ней и уже предвкушает двойную победу: одну над Каварадосси и Анджелотти и другую над Тоской, к которой он пылает страстью. Между тем звучит Te Deum, и барон заставляет себя погрузиться в благочестивые раздумья ("Va'Tosca! Nel tuo cuor s'annida Scarpia"; "Ну, Тоска, в грудь твою я влил отраву").
Действие второе: "Дворец Фарнезе". Скарпья посылает записку Тоске, чтобы она явилась, если любит Марио: он схвачен в домике. Начальник полиции допрашивает художника. Когда входит Тоска, Каварадосси успевает предупредить её, чтобы она не выдавала Анджелотти. Каварадосси уводят в соседнюю комнату на пытку. Его крики заставляют Тоску назвать место, где скрывается беглец. Марио проклинает её. В этот момент приходит весть о победе Наполеона. Каварадосси с вызовом обращается к Скарпье, прославляет свободу, республику ("Vittoria! Vittoria! L'alba vindice appar"; "Победа, победа! Гимн свободы, звучи!"). Его уводят.
Скарпья предлагает Тоске отдаться ему, в таком случае Марио будет спасён ("Gia. Mi dicon venal"; "Да, я деньги люблю"). Если же нет, его немедленно расcтреляют. Тоска в смятении ("Vissi d'arte, vissi d'amore"; "Только пела, только любила"). Наконец она соглашается, но требует сейчас же освободить Каварадосси. Скарпья обещает, что его расстрел будет произведён холостыми патронами, в присутствии Тоски он вручает приказ Сполетте. Тоска требует также пропуск для себя и Марио. Пока Скарпья пишет, она замечает на столе кинжал и решает убить барона, как только он к ней приблизится. Удар кинжалом сваливает его с ног. Когда барон умирает, Тоска берёт у него из рук пропуск, кладёт ему на грудь распятие и удаляется.
Действие третье: "Площадь тюрьмы Сант-Анджело" Светает. Раздаётся звон утренних колоколов. Слышится песня пастуха. Группа солдат ведёт Каварадосси на площадку тюремной башни, где через час он должен быть расстрелян. Художник просит передать письмо Тоске и, начавписать, погружается в воспоминания о прошлом ("E lucevan le stelle"; "В небе звёзды горели"). Неожиданно появляется Тоска: она показывает Каварадосси пропуск и рассказывает об убийстве Скарпьи. Марио целует ей руки ("O dolci mani mansuete e pure"; "О эти руки, ласковые руки"). Оба мечтают о близком счастье (дуэт "Amaro sol per te m'era il morto"; "Со мною ты - и солнца мне не надо"). Наступает время казни. Марио падает под выстрелами. Тоска, подбежав, хочет помочь ему встать: кровь открывает ей страшную правду. Слышатся голоса: убийство Скарпьи раскрыто, и полицейские идут арестовать Тоску. Но она поднимается на парапет и бросается вниз.
